Епархия была учреждена 5 апреля 1829 года как самостоятельная Новочеркасская и Георгиевская епархия, будучи выделена из состава Воронежской. В её состав вошли Область войска Донского, Черноморское войско и Кавказская область. Архиерею присвоен титул Новочеркасского и Георгиевского.
С 11 января 1830 года епархия являлась архиепископией.
Указом от 17 июля 1842 года из Новочеркасской епархии на землях Черноморского казачьего войска и Северного Кавказа была выделена Кавказская и Черноморская епархия. Сама епархия была переименована в Донскую и Новочеркассую. Кафедральным городом епархии остался Новочеркасск.
По сведениям за 1901 год, церквей в епархии 586, монастырей 4 (два мужских и два женских), церковных школ 923, учащихся в них 41712 (до 15 000 девочек), церковно-приходских попечительств 485. Духовная семинария, два духовных училища (Новочеркасское и Усть-медведицкое) и епархиальное женское училище.
В 1935 году епископ Антоний (Романовский) был назначен на Ставропольскую кафедру с титулом «Ставропольский, Донской и Сталинградский».
Во время немецкой оккупации епископ Николай (Амасийский), бывший Ростовский, по собственному почину вступил в управление Донской епархией и номинально вошёл в состав Украинской Автономной Церкви под началом архиепископа Алексия (Громадского). Накануне освобождения Ростова-на-Дону Советской армией епископ Николай отбыл в Румынию.
В 1943 году основная территория Донской епархии вошли в состав Ростовской епархии, друая часть в — в Сталинградскую епархию.